Elisa酶联免疫技术平台                     

一、ELISA基本原理

       ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

二、ELISA的类型

       ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：

（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；

（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；

（3）酶反应的底物。

根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

1、双抗体夹心法测抗原

2、双抗原夹心法测抗体

　　反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

3、间接法测抗体

4、竞争法测抗体

5、竞争法测抗原
　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

6、 捕获包被法测抗体

7、 ABS-ELISA法
　　ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。

由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。

在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

三、ELISA试剂盒的组成

完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。

四、ELISA实验基本操作

1、移液器使用基本操作及注意事项；

2、洗板基本操作及注意事项；

3、抗原固相化；

4、抗原抗体效价测定；

5、间接竞争法（两步法）基本原理及操作基本步骤；

6、标准曲线及变异系数测定；

7、数据分析及软件应用；

五、ELISA实验相关术语、概念

1、抗原、免疫原、半抗原、标准品；

2、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体；

3、 IC50、相关系数、抑制、抑制率、灵敏度；

4、特异性、交叉反应率；

5、准确度、精密度、变异系数；

6、样本、阳性样本、阴性样本、假阳性、假阴性、超阴、检测限、判定限、回收率、高检测限、低检测限；

厚生正德ELISA免疫技术平台的特点：

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